温热疗法对癌症治疗的作用(转北京大学临床肿瘤学院张珊文)之一

              热分子生物学和基因热疗的进展热疗的作用靶是真核细胞的核染色体具有双螺旋结构的DNA，产生单链断裂（可修复）和双链断裂（不可修复）。加温诱导产生的应激蛋白－热休克蛋白70 ( HSP70, heat shock protein )有促进细胞损伤修复的作用，HSP和肿瘤细胞内变异p53基因结合，降低了细胞热敏感性，HSP增加肿瘤细胞热抵抗性的作用，可以通过重组腺病毒携带野生型p53转录入肿瘤细胞内来克服。另一方面还应看到：HSP可激活免疫系统，表现为激活单核细胞( monocytes)(包括巨噬细胞，macrophage)和使单核细胞来源的( monocyte-derived ) 树突状细胞（dendritic cell, DC）成熟，从而激活分泌前炎性反应细胞因子（secrete proinflammatory cytokines）如TNF-a 和 IL-1b, 等, 和激活以发挥肿瘤杀伤作用的免疫成分T细胞，主要为杀伤性T细胞（CTL）。热疗中看到肿瘤组织明显的坏死和免疫细胞聚集，这是热疗提高人体免疫功能的主要机制和病理表现。加温使细胞内溶酶体酶活性增加，其崩解释放的消化酶使损伤细胞蛋白消化溶解。加温诱导产生的肿瘤坏死因子a ( TNFa, tumor necrosis factor )对细胞凋亡起促进作用。加温尤其是在高温下，细胞内DNA损伤修复的聚合酶活性下降，使加温所致DNA损伤修复受阻。加温产生细胞周期阻滞，由此启动修复过程。如果细胞损伤不能修复，将引发细胞程序化死亡过程，即凋亡发生。P53抑癌基因对加温后细胞周期阻滞和凋亡都起着重要的调控作用。P53基因位于人17号染色体上 （ 17p13.1 ）,小鼠第11号染色体上，因编码一分子量53KD的核磷酸蛋白而得名。P53基因全长约20kb，有11个外显子，10个内含子，编码393个氨基酸。P53蛋白有三个结构区：N－末端为酸性区，具有转录激活功能，可与许多转录因子相互作用；中央疏水区富含脯氨酸具有序列特异性DNA结合特性；C－末端是碱性区，为高活性的关键区域，易形成a螺旋和转角结构，其寡聚区 （ 第319－360氨基酸残基）所形成的二聚体或四聚体对于p53蛋白与系列特异性DNA的结合而发挥的反式激活功能具有关键作用。P53基因的主要功能：一是作为细胞周期检查点 ( checkpoint ), 起分子警察的作用。即细胞受损时，DNA损伤可诱导短时间p53基因的表达，p53蛋白可与DNA调控区结合，使CKI基因WAF1/ CIP1( WAF1, wild-type p53 transactivated gene, CIP1, Cdk-interacting protein ) 表达，其产物为p21蛋白，而p21可抑制细胞周期蛋白D激酶 （ CDK ）活性，使cyclin-cdk不能磷酸化pRb，从而阻碍了E2F的释出，使DNA合成的有关基因不能表达，使细胞不能进入DNA合成的S期，这样损伤的细胞则停滞在G1期，为细胞DNA的修复创造条件。P53除了诱导和促进G1期阻滞外，还有观察到对某些细胞的G2期阻滞。P53基因的另一重要功能是诱导细胞凋亡。当细胞DNA损伤不能修复时，p53会诱导细胞进入编程化死亡过程。它可能通过两种途径来调控凋亡：一是通过特异性转录激活 ( sequence specific transcription activation, SST )方式，p53直接激活死亡基因，如bax，或者抑制存活基因，如bcl-2。Bax 比例上调，和/或bcl-2比例下调，均可促进细胞凋亡。二是p53通过非SST依赖途径起作用。P53基因对肿瘤组织有抑制作用，一是它可抑制肿瘤细胞生长，二是它可抑制肿瘤血管的生成，其机制可能是p53通过抑制血管内皮生长因子 ( VEGF )的作用有关。P53基因与肿瘤细胞的热敏感性密切相关。对于携带野生型p53的细胞，加温后p53表达增加，对加温引导的凋亡效应起促进作用，对于携带突变型p53的细胞，加温后突变型p53表达也增加，与加温产生的热休克蛋白70协同，对加温引导的凋亡效应起减弱作用。加温使肿瘤细胞产生细胞周期G1期或S期阻滞，并引发凋亡。具有正常功能的野生型p53可以增强细胞热效应, 使细胞周期阻滞更延迟和凋亡比例增加，而p53缺失或变异将会减弱或失去这种作用。本作者采用本研究所肿瘤分子生物室构建的带有不同p53状况的4种人胃腺癌细胞，即通过脂质体介导的野生型p53基因质粒、突变型p53基因质粒、和无p53基因的空载质粒转移进有p53缺陷的人胃癌BGC－823细胞中，其中带有野生型p53 的BGC823-wtp53细胞 ( 略为W细胞 )，带有突变型p53 的BGC823-mutp53细胞 ( 略为M 细胞 )，带无 p53空载质粒的BGC823－vect细胞 （略为neo细胞）和亲本BGC823细胞 （ 略为823细胞 ），用于本实验。用FCM分析加热42°C，2h或43°C，30min后，在37°C培养下，8h或16h后，4种细胞的细胞周期再分布和凋亡的比例，结果显示在37°C对照条件下，4种细胞的细胞周期各时相比例都没有明显差异。在两种加温条件下，在37°C恢复8h或16h后，只有W细胞出现强烈的S期阻滞，在16h后出现明显的预示凋亡的Sub-G1峰，而其他3种p53异常细胞的细胞周期各时相都没有发生明显的变化，也没有出现Sub-G1峰。43°C，30min两次加温4种细胞种植肿瘤，其肿瘤相对体积曲线显示，W细胞肿瘤生长比其他3种细胞肿瘤更明显受到抑制。以上实验结果充分说明，野生型p53促进了加温所产生的细胞周期阻滞和凋亡，从而明显地提高了肿瘤细胞的热敏感性。重组腺病毒介导p53(recombinant adenovirus-mediated p53, rAdp53)在高效靶比（100MOI）剂量下，产生细胞高转染率和p53基因在四种胃癌细胞中均高表达，并产生G2/M期阻滞和凋亡和细胞增殖抑制。Adp53基因的作用不依赖胃癌细胞内在的p53状态。如果以凋亡作为热效应，Adp53对两种加温方式42°C，2h或43°C，30min的热增敏比，对W细胞为1.6~3.3,而对M细胞为1.8~2.1。Adp53对W细胞肿瘤43°C 0.5h加温的热增敏比为1.7,而对M细胞肿瘤为1.6。实验证明：腺病毒介导p53基因提高了人胃癌细胞的热敏感性，这种作用不依赖于细胞内在p53状况。本实验为p53基因治疗与热疗结合提供了可靠的实验依据。从2001年10月，至今我们完成了我国重组人p53腺病毒（商品名：今又生）的临床试验，证明今又生可以提高头颈鳞癌的放疗即刻疗效2～3倍，该基因治疗药品已被国家FDA批准为国家I类新药，成为世界上第一个批准上市的基因治疗药物。我们还用腹腔灌注今又生结合腹腔热化疗治疗25例腹盆腔广泛转移癌，得到72％获益率（详细报告见本会），还用今又生瘤内注射结合热疗治疗了7例复发难治肿瘤，取得明显疗效。我们已经将p53基因热疗（p53 gene-hyperthermia）从实验研究走向临床试验，使热疗的疗效提高到一个新的水平。(论文发表在日本权威热疗杂志： Japanese Journal of Hyperthermic Oncology, Vol.19, No.3:p11~19, 2003)（详细报告请上中华热疗网：http://www.h-y.org.cn www.hyperthermia.com）   加温对细胞产生的分子效应摘引杨耀琴文， 关于热休克蛋白的研究在外界各种因素的作用下，例如热的作用，诱发热休克蛋白（Heat Shock Protein, HSP）又称应激蛋白(Stress Protein ), 引起热休克蛋白表达的共同原因可能是由于变性蛋白在细胞内的积累或异常蛋白质产生或蛋白质合成受阻。其中最重要的是HSP70，一族分子量68~80KD的伴侣蛋白。HSP70s的产生与细胞的热耐受性有密切的关系。 细胞或组织受到一过性的亚致死性加温后，当这些细胞或组织再次受到温热时，会产生对温热的抵抗能力，这被称为温热耐受性。伴随产生热休克蛋白。1. 热耐受性的产生的形式：两种加温方式产生温热耐受性。一是当细胞长时间（2小时以上）43℃以下加温，细胞生存率曲线斜率会慢慢趋向平坦。另一种为细胞经初次加温后，回到41℃以下的温度，经过数小时或更长时间的培养后，细胞对此后的第二次加温会产生较强的耐热性，这种为分次加温耐热性。至今，大量细胞培养研究表明正常细胞与肿瘤细胞的耐热性并无显著差别。动物移植肿瘤的体内实验中，也同样可见正常组织、肿瘤组织均有温热耐受性，幸好这种温热耐受性常于数天后即消失。这也是临床上为什么通常进行间隔温热疗法的理论依据。 2. 温热耐受性和热休克蛋白（HSP）的关系热耐受性产生的同时，细胞内正常蛋白质合成被抑制，而一组特殊的蛋白质合成却明显增加，这种反应就是热休克反应，这组蛋白质称为热休克蛋白（ Heat Shock Protein，HSP）。目前为止，已发现哺乳类动物细胞内存在着十多种HSP，其中HSP 70家族在热休克反应中起主要作用，是热耐受性形成的基础 。在正常状态下，HSP70与新合成蛋白质的正确折叠和运输有关，并帮助进入膜结构（如线粒体、内质网、细胞核等）的蛋白质转变成伸展状态，以利于通过膜结构或结合，为此被称为伴随分子。HSP70具有ATP酶活性，对变性蛋白比未变性蛋白亲和力高，能利用分解ATP的能量修复变性的蛋白质，因此，具有在应激条件下维持细胞机能的作用。目前认为温热耐受性与细胞经一时性的加热后，热对细胞的损伤（蛋白质的变性等）诱发细胞内HSP70的表达增加和向核内转移有关，据报道过多表达的HSP70可以使被抑制的转录和蛋白质合成迅速恢复，细胞防护机能亢进和修复机能增强，如前所述，HSP70既能防护由于热所引起的蛋白质变性，又能修复变性蛋白质，可以考虑HSP70（可能还包括HSP40）含量多的细胞，蛋白质保护和修复的机能亢进。此外，通过基因缺失、基因转移改变HSP70的表达，可直接改变细胞的热敏感性和热耐受性。这些结果都显示了HSP与温热耐受性及温热抵抗性有密切的关系。HSP与DC（Dendritic Cells）HSP可激活免疫系统，表现为激活单核细胞( monocytes)(包括巨噬细胞，macrophage)和使单核细胞来源的( monocyte-derived ) 树突状细胞（dendritic cell, DC）成熟，从而激活分泌前炎性反应细胞因子（secrete proinflammatory cytokines）如TNF-a 和 IL-1b, 等, 和激活以发挥肿瘤杀伤作用的免疫成分T细胞主要为杀伤性T细胞（CTL）。HSP play a role in immune activation and recognition. DC对激活T细胞尤其Th细胞的分化起决定作用。（可用Enhancer图1和图2）成熟的DC细胞是potennt antigen-presenting cells （强大的抗原递呈细胞），which can prime（活化） naive(幼稚) T cells and induce atrong memory T cell responses. Besides the induction of antigen-specific CD8+ cytolytic T cells ( CTLs) and CD4+ helper T cells, DCs are able to activate natural killer (NK) cells, NK T (NKT) cells and B cells (Figure 1). (中华热疗学会 )MSN:dupaa@hotmail.com msn空间完美搬家到新浪博客!