常用检测细胞凋亡技术

细胞凋亡检测 1、 早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、 晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) Telemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。 注意事项 一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。 细胞产生不可修复的DNA损伤后通常会程序性死亡，或称凋亡。然而在肿瘤细胞中这一机制失去作用，所以它能够肆意增殖，拒绝接受“自杀”的命令。德国科学家近日发现了其中的可能原因——肿瘤细胞会降解一种能触发凋亡的蛋白。抑制这种蛋白的降解能够使凋亡机制恢复作用，并将提升放疗和化疗的效力。相关论文发表在《自然—细胞生物学》（Nature Cell Biology）上。 严重DNA损伤后触发凋亡的其中一类蛋白是HIPK2分子。德国癌症研究中心的Thomas Hofmann和同事研究发现，HIPK2不断在健康细胞中产生，但一种名为Siah-1的酶将它标记为“垃圾”，所以它又立刻被降解。 轻微损伤的细胞会进入一种低级警戒状态——短时间内抑制HIPK2的降解。一旦损伤得到修复，细胞会立即恢复对HIPK2的降解。只有在严重损伤（比如DNA双链均遭破坏）的细胞中，HIPK2的降解才被永久性地抑制。结果HIPK2不断积累，触发凋亡，细胞自杀。 研究人员推测，这可能就是放疗和化疗有时失效的原因。这两种治疗方法都会严重损伤肿瘤细胞，最终导致它们的程序性死亡。Thomas Hofmann说：“如果有抵抗发生，经常是由于肿瘤细胞‘拒绝’执行自杀的命令。” 研究人员在实验中抑制了Siah-1酶，结果发现，即使在轻微损伤的细胞中，HIPK2也能够积聚，凋亡也被触发。Hofmann推测，“癌医学将可能利用这一发现。比如，我们可以将Siah-1抑制剂与放疗或化疗结合使用，从而将细胞拉回到凋亡机制中来。